हाइड्रोफोबिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी
2.क्रोमैटोग्राफिक कॉलम (रोटेशन प्रकार)
3. क्रोमैटोग्राफिक कॉलम (मैनुअल)
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विवरण
तकनीकी पैरामीटर
हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी(एचआईसी) एक शक्तिशाली तकनीक है जो मुख्य रूप से प्रोटीन के पृथक्करण और शुद्धि में उपयोग की जाती है, विशेष रूप से उन लोगों के पास जो हाइड्रोफोबिक गुण हैं। यह क्रोमैटोग्राफिक विधि नमूना अणुओं और स्थिर चरण के बीच अंतर हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन का लाभ उठाती है, जो मोबाइल चरण के साथ क्षालन के दौरान उनके प्रवासन की गति के आधार पर घटकों के पृथक्करण को सक्षम करती है। इस व्यापक लेख में, हम हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के सिद्धांतों, संचालन, अनुप्रयोगों, फायदे, नुकसान, और हाल की प्रगति में बदल देंगे।
पैरामीटर
हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के सिद्धांत
एचआईसी की नींव प्रोटीन अणुओं और स्थिर चरण से जुड़ी हाइड्रोफोबिक लिगेंड के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन में निहित है। प्रोटीन, प्रकृति में एम्फ़िपैथिक होने के नाते, हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक दोनों अवशेष होते हैं। जलीय घोलों में, हाइड्रोफिलिक अवशेषों का सामना करना पड़ता है, पानी के अणुओं के साथ बातचीत करते हुए, जबकि हाइड्रोफोबिक अवशेषों को अक्सर प्रोटीन की तृतीयक संरचना के भीतर दफन किया जाता है। हालांकि, कुछ शर्तों के तहत, जैसे कि उच्च नमक सांद्रता की उपस्थिति, ये हाइड्रोफोबिक अवशेष उजागर हो सकते हैं, क्रोमैटोग्राफिक मैट्रिक्स पर हाइड्रोफोबिक लिगेंड के साथ उनकी बातचीत को बढ़ावा देते हैं।
एचआईसी में मोबाइल चरण में आमतौर पर 6-8 की पीएच रेंज के साथ एक बफर खारा समाधान होता है। उच्च नमक सांद्रता को हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को बढ़ाने के लिए नियोजित किया जाता है, जो स्थिर चरण में प्रोटीन के बंधन को सुविधाजनक बनाता है। मोबाइल चरण में नमक की एकाग्रता की क्रमिक कमी से क्षालन की शक्ति बढ़ जाती है, जिससे प्रोटीन को उनके हाइड्रोफोबिसिटी के आधार पर eluted किया जा सकता है। कमजोर हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन वाले प्रोटीन को पहले eluted किया जाता है, इसके बाद मजबूत इंटरैक्शन वाले होते हैं।
क्रोमैटोग्राफिक मैट्रिक्स और मोबाइल चरण
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क्रोमैटोग्राफिक मैट्रिक्स की पसंद एचआईसी में महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह सीधे अलग -अलग प्रोटीन की पृथक्करण दक्षता और शुद्धता को प्रभावित करता है। मैट्रिसेस को कमजोर हाइड्रोफोबिक लिगेंड के साथ डिज़ाइन किया गया है ताकि प्रोटीन के विकृतीकरण और अपरिवर्तनीय सोखने से बचने के लिए अक्सर उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी में देखा जा सके। सामान्य मैट्रिसेस में एग्रोज़, पॉलीक्रैलेमाइड और सिलिका-आधारित जैल शामिल हैं, जिन्हें फिनाइल, ब्यूटाइल या प्रोपाइल लिगेंड जैसे हाइड्रोफोबिक समूहों के साथ संशोधित किया गया है। मोबाइल चरण रचना एचआईसी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। उच्च नमक सांद्रता, जैसे कि अमोनियम सल्फेट ((NH4) 2SO4) या सोडियम क्लोराइड (NaCl), हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किया जाता है। बफर के पीएच को प्रोटीन स्थिरता बनाए रखने और स्थिर चरण के लिए बाध्यकारी का अनुकूलन करने के लिए सावधानीपूर्वक समायोजित किया जाता है। बफर की एकाग्रता, आमतौर पर 0 से लेकर {0 1 से 0.05 mol/l, अलगाव प्रक्रिया को भी प्रभावित करती है। |
एचआईसी की परिचालन प्रक्रिया
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एचआईसी की परिचालन प्रक्रिया में कई प्रमुख चरण शामिल हैं, जिनमें नमूना तैयारी, लोडिंग, क्षालन और क्रोमैटोग्राफिक कॉलम के पुनर्जनन शामिल हैं। ◆ नमूना तैयारी: लोडिंग से पहले, नमूनों को आमतौर पर मोबाइल चरण ए (संतुलन बफर) के नमक एकाग्रता और पीएच से मेल खाने के लिए समायोजित किया जाता है। यह इष्टतम बाध्यकारी स्थितियों को सुनिश्चित करता है और नमूना कमजोर पड़ने को कम करता है। ◆ लोड हो रहा है: नमूना कॉलम पर लागू होता है, जहां प्रोटीन उनके हाइड्रोफोबिसिटी के आधार पर स्थिर चरण के साथ बातचीत करते हैं। ◆ क्षालन: मोबाइल चरण में नमक की एकाग्रता को धीरे -धीरे कम करके क्षालन प्राप्त किया जाता है, जो हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को कमजोर करता है और हाइड्रोफोबिसिटी को बढ़ाने के क्रम में प्रोटीन को eluted करने की अनुमति देता है। ◆ पुनर्जनन: उपयोग के बाद, कॉलम को डिस्टिल्ड पानी या उपयुक्त सफाई एजेंटों के साथ धोने से पुनर्जीवित किया जाता है ताकि कसकर बाध्य दूषित पदार्थों को हटाया जा सके और बाद के रन के लिए कॉलम तैयार किया जा सके। |
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हाइड्रोफोबिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी की पद्धति
हाइड्रोफोबिक कॉलम क्रोमैटोग्राफी की कार्यप्रणाली में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं, जिसमें नमूना तैयार करना, स्तंभ संतुलन, नमूना लोड करना, क्षालन और अंशों का संग्रह शामिल है।
◆ नमूना तैयारी:
कॉलम पर नमूना लोड करने से पहले, मोबाइल चरण ए (संतुलन बफर) के नमक एकाग्रता से मेल खाने के लिए पर्याप्त नमक जोड़कर नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है। नमूना समाधान के पीएच को सोखना की स्थिति को पूरा करने के लिए भी समायोजित किया जाना चाहिए।
◆ स्तंभ संतुलन:
स्तंभ मोबाइल चरण ए के साथ संतुलित है, जो एक विशिष्ट पीएच और नमक एकाग्रता का एक बफर खारा समाधान है। यह सुनिश्चित करता है कि स्थिर चरण बफर के साथ संतृप्त है, नमूना प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए तैयार है।
◆ नमूना लोड करना:
तैयार नमूना कॉलम पर लोड किया गया है। नमूने की मात्रा घटक एकाग्रता और मीडिया की बाध्यकारी क्षमता से प्रभावित होती है। पतला नमूनों के लिए, प्रत्यक्ष लोडिंग पूर्व एकाग्रता के बिना संभव है।
◆ क्षालन:
धीरे -धीरे मोबाइल चरण के नमक एकाग्रता को कम करके, एल्यूशन प्राप्त किया जाता है, जिससे प्रोटीन और स्थिर चरण के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को कमजोर किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, अपनी ध्रुवीयता को बदलने या बाध्य प्रोटीन को विस्थापित करने के लिए मोबाइल चरण में कार्बनिक सॉल्वैंट्स या डिटर्जेंट को जोड़कर क्षीणता प्राप्त की जा सकती है।
◆ अंशों का संग्रह:
लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धता और वसूली का आकलन करने के लिए eluted अंशों को एकत्र किया जाता है और विश्लेषण किया जाता है।
पृथक्करण को प्रभावित करने वाले कारक
कई कारक हाइड्रोफोबिक कॉलम क्रोमैटोग्राफी में प्रोटीन की पृथक्करण दक्षता और शुद्धता को काफी प्रभावित करते हैं:
◆ नमक एकाग्रता और प्रकार:
मोबाइल चरण में नमक का प्रकार और एकाग्रता हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को संशोधित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। अमोनियम सल्फेट और सोडियम क्लोराइड जैसे लवण का उपयोग आमतौर पर किया जाता है, जिसमें सांद्रता 0 से होती है। 75 से 2 मोल/एल अमोनियम सल्फेट के लिए और सोडियम क्लोराइड के लिए 1 से 4 मोल/एल।
◆ पीएच:
मोबाइल चरण का पीएच प्रोटीन के चार्ज राज्य और हाइड्रोफोबिसिटी को प्रभावित करता है। प्रोटीन के आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट से एक पीएच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को कम करके एल्यूशन का पक्ष लेता है।
◆ तापमान:
स्तंभ तापमान बढ़ाने से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन बढ़ सकते हैं, जिससे अलगाव दक्षता में सुधार हो सकता है।
◆ प्रवाह दर:
प्रवाह दर स्तंभ में प्रोटीन के निवास समय को प्रभावित करती है, स्थिर चरण के साथ उनकी बातचीत को प्रभावित करती है।
◆ स्तंभ विशेषताएँ:
स्तंभ की लंबाई, व्यास और पैकिंग सामग्री सभी पृथक्करण दक्षता में योगदान करती हैं। स्थिर चरण सामग्री और इसके सतह गुणों की पसंद भी महत्वपूर्ण हैं।
हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के अनुप्रयोग
एचआईसी विभिन्न प्रोटीनों की शुद्धि में व्यापक अनुप्रयोग पाता है, जिसमें सीरम प्रोटीन, झिल्ली-बाउंड प्रोटीन, परमाणु प्रोटीन, रिसेप्टर्स और पुनः संयोजक प्रोटीन शामिल हैं। इसकी कोमल पृथक्करण की स्थिति इसे सक्रिय पदार्थों की शुद्धि के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाती है, जैसे कि एंजाइम, एंटीबॉडी और अन्य चिकित्सीय प्रोटीन।
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◆ प्रोटीन शुद्धि: एचआईसी का उपयोग अक्सर उच्च शुद्धता स्तर प्राप्त करने के लिए आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी या आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी जैसे अन्य क्रोमैटोग्राफिक तरीकों के बाद एक पॉलिशिंग कदम के रूप में किया जाता है। ◆ एंटीबॉडी शुद्धि: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और अन्य इम्युनोग्लोबुलिन को एचआईसी का उपयोग करके प्रभावी रूप से शुद्ध किया जा सकता है, चिकित्सीय और नैदानिक अनुप्रयोगों में उनके उपयोग को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। ◆ प्रोटीन वेरिएंट का पृथक्करण: एचआईसी प्रोटीन आइसोफॉर्म, सक्रिय और निष्क्रिय रूपों, और छंटनी की गई प्रजातियों के बीच अंतर कर सकता है, बायोफार्मास्यूटिकल्स के लक्षण वर्णन और गुणवत्ता नियंत्रण में सहायता कर सकता है। |
हिक के फायदे और नुकसान
लाभ:
1) उच्च वसूली दर: एचआईसी प्रोटीन की उच्च वसूली दर प्रदान करता है, जिससे यह बड़े पैमाने पर शुद्धि प्रक्रियाओं के लिए कुशल हो जाता है।
2) प्रोटीन गतिविधि को बनाए रखा: हल्के पृथक्करण की स्थिति प्रोटीन विकृतीकरण और गतिविधि के नुकसान को कम करती है।
3) बहुमुखी प्रतिभा: हाइड्रोफोबिक गुणों के साथ प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला की शुद्धि के लिए एचआईसी को अनुकूलित किया जा सकता है।
नुकसान:
1) सीमित घुलनशीलता: कुछ प्रोटीन एचआईसी में उनकी प्रयोज्यता को सीमित करते हुए, उच्च नमक सांद्रता में घुलनशीलता को कम कर सकते हैं।
2) नमक हस्तक्षेप: मोबाइल चरण में उच्च नमक सांद्रता बाद के विश्लेषणात्मक चरणों में हस्तक्षेप कर सकती है, अतिरिक्त डिसालिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता है।
हाल की प्रगति और भविष्य के निर्देश
एचआईसी में हाल की प्रगति ने उपन्यास क्रोमैटोग्राफिक मैट्रिसेस के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसमें पृथक्करण क्षमता और स्थिरता के साथ वृद्धि हुई है। हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (HILIC) सिद्धांतों और मिश्रित-मोड रेजिन के उपयोग के समावेश ने ध्रुवीय यौगिकों के पृथक्करण के लिए HIC की प्रयोज्यता का विस्तार किया है।
इसके अलावा, अन्य क्रोमैटोग्राफिक तकनीकों के साथ एचआईसी का एकीकरण, जैसे कि आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी या आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, ने अधिक कुशल और मजबूत शुद्धि प्रोटोकॉल के विकास की सुविधा प्रदान की है। स्वचालन और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों ने भी एचआईसी प्रक्रियाओं की स्केलेबिलिटी और प्रजनन क्षमता में योगदान दिया है।
एचआईसी अनुसंधान में भविष्य की दिशाओं में वैकल्पिक लिगेंड्स और मैट्रिसेस की खोज शामिल है ताकि अलगाव की क्षमता में सुधार किया जा सके और अनुप्रयोगों के दायरे को व्यापक बनाया जा सके। अधिक पर्यावरण के अनुकूल और टिकाऊ मोबाइल चरणों का विकास, साथ ही साथ प्रोटीन विकृतीकरण को कम करने के लिए क्षालन की स्थिति का अनुकूलन, चल रहे अनुसंधान के क्षेत्र बने हुए हैं।
अंत में, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन के पृथक्करण और शुद्धि के लिए एक बहुमुखी और प्रभावी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से हाइड्रोफोबिक गुणों के साथ। नमूना अणुओं और स्थिर चरण के बीच अंतर हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन का लाभ उठाकर, एचआईसी विभिन्न चिकित्सीय, नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन की शुद्धि को सक्षम करता है। क्रोमैटोग्राफिक सामग्री, स्वचालन, और अन्य तकनीकों के साथ एकीकरण में चल रही प्रगति के साथ, एचआईसी का भविष्य बायोफार्मास्यूटिकल्स के क्षेत्र में और भी अधिक क्षमता और व्यापक प्रयोज्यता का वादा करता है।
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