पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी
2.क्रोमैटोग्राफिक कॉलम (रोटेशन प्रकार)
3. क्रोमैटोग्राफिक कॉलम (मैनुअल)
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विवरण
तकनीकी पैरामीटर
पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफीस्थिर चरण और मोबाइल चरण के बीच विभिन्न पदार्थों के वितरण अनुपात में अंतर का उपयोग करता है, या विभिन्न पदार्थों के सापेक्ष निश्चित चरणों की विभिन्न अवधारण क्षमताओं को प्राप्त करने के लिए, पदार्थ पृथक्करण प्राप्त करने के लिए। जब मिश्रण मोबाइल चरण के साथ क्रोमैटोग्राफिक कॉलम के माध्यम से बहता है, तो यह कॉलम में स्थिर चरण (जैसे विघटन, सोखना, आदि) के साथ बातचीत करेगा। मिश्रण में प्रत्येक घटक के भौतिक और रासायनिक गुणों और संरचनाओं में अंतर के कारण, स्थिर चरण के साथ उनकी बातचीत की परिमाण और ताकत भी भिन्न होती है। एक ही ड्राइविंग बल के तहत, स्थिर चरण में प्रत्येक घटक का अवधारण समय अलग है, ताकि मिश्रण में घटक एक निश्चित क्रम में स्तंभ से बाहर निकलते हैं, पृथक्करण प्राप्त करते हैं।
पैरामीटर
कीटनाशक अवशेषों का पता लगाना
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हम अक्सर ऐसा कहते हैंपारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफीवास्तव में कॉलम क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण है, जिसे कॉलम क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है। यह पहली बार 1903 में रूसी वैज्ञानिकों द्वारा उपयोग किया गया था। अलग -अलग रंग बैंडों को अलग करने और निकालने से, अपेक्षाकृत शुद्ध क्लोरोफिल, ल्यूटिन, आदि प्राप्त किए गए थे।
सौ वर्षों के विकास के बाद, यह विधि अपेक्षाकृत परिपक्व हो गई है, और स्थिर चरण भी एक एकल कैल्शियम कार्बोनेट पाउडर से एल्यूमिना (जिसे अम्लीय, तटस्थ, क्षारीय), सिलिका जेल, सक्रिय कार्बन, आदि में विभाजित किया जा सकता है, उनमें से, सिलिका जेल को सामान्य चरण में विभाजित किया जाता है, आमतौर पर सामान्य चरण में विभाजित किया जाता है।
स्थिर चरण (सिलिका जेल) को आमतौर पर शुद्ध और सक्रिय करने की आवश्यकता होती है, और कण का आकार समान होना चाहिए। सिद्धांत रूप में, कण का आकार और प्रति यूनिट द्रव्यमान की सतह क्षेत्र जितना छोटा होता है, उतना ही अधिक सोखने की क्षमता और अलग -अलग प्रभाव।
हालांकि, व्यावहारिक उपयोग में, जब निश्चित चरण कण बहुत छोटे होते हैं, तो अक्सर दो स्थितियां होती हैं: एक यह है कि वे वजन में हल्के होते हैं और आसानी से हवा में तैरते हैं (सिलिका जेल को मानव शरीर द्वारा नीचा नहीं किया जा सकता है, और महीन, यह अधिक विषाक्त है); दूसरे, छोटे कण भी कणों के बीच छोटे अंतराल को जन्म दे सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप धीमी गति से प्रवाह दर और समय की खपत होती है; एक उदाहरण के रूप में सिलिकॉन लेते हुए, सिलिकॉन का सबसे बड़ा व्यावसायिक रूप से उपयोग किया जाने वाला आकार वर्तमान में 200-300 मेष है।
कॉलम पासिंग विधियों के संदर्भ में, स्वचालित विश्लेषण उपकरण जैसे कि फॉरवर्ड सर्कुलेशन तैयारी, कुशल तरल चरण की तैयारी, और कॉलम पासिंग मशीनों के अलावा, पहले उल्लेख किया गया है, मैनुअल कॉलम पासिंग को मुख्य रूप से तीन प्रकारों में विभाजित किया गया है: वायुमंडलीय दबाव कॉलम पासिंग, डिप्रेसरीकरण कॉलम पासिंग, और दबाव स्तंभ पासिंग।
उनमें से, स्तंभ के माध्यम से अवसाद का परिणाम खराब सोखना दक्षता में होता है, जो कि एलुएंट की तेजी से प्रवाह दर के कारण होता है, जो ट्रे की अधिकांश संख्या और खराब पृथक्करण दक्षता के नुकसान की ओर जाता है। यह अपेक्षाकृत खुली टीएलसी प्लेटों के साथ नमूनों को अलग करने के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से उत्पाद में केवल एक बड़ी ध्रुवीय अशुद्धता के साथ नमूनों के लिए; इसका अधिकांश समय यौगिकों के पूर्व-उपचार पर व्यतीत होता है, सावधानीपूर्वक शुद्धिकरण से पहले कुछ अशुद्धियों को दूर करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उपयोग के दौरान नकारात्मक दबाव के कारण होने वाले विलायक वाष्पीकरण से स्तंभ की बाहरी सतह पर बड़ी संख्या में पानी की बूंदों का संक्षेपण हो सकता है। जल संवेदनशील यौगिकों को आसानी से प्रयास नहीं किया जाना चाहिए।
वायुमंडलीय दबाव स्तंभ पासिंग तीनों के बीच सबसे प्रभावी पृथक्करण विधि है, लेकिन क्योंकि विलायक अक्सर बहुत धीरे -धीरे चलता है, यहां तक कि सबसे अच्छा पृथक्करण प्रभाव दक्षता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, दबाव आमतौर पर इस समय लागू होता है, जिसे दबाव वाले कॉलम पासिंग कहा जाता है; लेकिन दबाव बहुत अधिक नहीं होना चाहिए। आम तौर पर, एक डबल चेन बॉल का उपयोग मैनुअल ऑपरेशन के लिए किया जाता है, और एक मछली पंप का उपयोग स्वचालित संचालन के लिए किया जाता है। दोनों को चित्र में दिखाया गया है।
परंपरागत स्तंभ क्रॉसिंग प्रक्रिया:
तैयारी का काम अच्छी तरह से किया जाना चाहिए:
एक कॉलम का चयन करते समय, देखें कि क्या एक सैंडिंग बोर्ड है। सैंडिंग बोर्डों के बिना कॉलम के लिए, कुछ कपास के साथ नीचे भरना याद रखें। कपास बहुत मोटी या बहुत पतली नहीं होनी चाहिए, जब तक कि यह सिलिकॉन को बंद करने से रोक सकता है। (ब्लॉगर ने सीधे एक कपड़े हैंगर को नष्ट कर दिया और इसका इस्तेमाल प्लग पर आउटलेट में कपास डालने के लिए किया)
न्यूनतम ध्रुवीयता एलुएंट, यूवी दीपक (प्रयोगशाला कर्मियों के लिए अनुशंसित, हैंडहेल्ड, किसी भी समय एक फोटो लेने के लिए तैयार), दबाव उपकरण, और आवश्यक के रूप में टेस्ट ट्यूब रैक तैयार करें!
एक उपयुक्त कॉलम का चयन करें, सिलिकॉन जेल जोड़ें, सिलिकॉन जेल को भिगोएं, और इसे चपटा करें
का चयनपारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफीबहुत महत्वपूर्ण है, और उनके आकार की गणना उत्पाद की मात्रा के आधार पर की जानी चाहिए, जिसे आम तौर पर विभाजित किया जा सकता है:
स्तंभ के कुछ मिलीग्राम (कुल संश्लेषण के लिए अंतिम विकल्प);
कई दसियों मिलीग्राम (पद्धतिगत विस्तार सब्सट्रेट) का एक स्तंभ;
500 मिलीग्राम से 1 ग्राम कॉलम (कच्चे माल के रूप में कार्यप्रणाली का उपयोग करके);
5g और बड़े पैमाने के आसपास के खंभे।
प्रयोगशाला में ऊंचाई तक स्तंभ व्यास का सबसे आम अनुपात आम तौर पर 1: 2.5 और 1:15 के बीच होता है। नमूना लोडिंग के दौरान स्थिर चरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले सिलिका जेल की मात्रा नमूने के बारे में 20 से 40 गुना है। कॉलम का चयन करने का मानक आपके नमूने की टीएलसी प्लेट चढ़ाई की स्थिति पर आधारित होना चाहिए। यदि निकट निकटता में कई अशुद्धियां हैं, तो जितना संभव हो उतना बड़ा कॉलम चुनने का प्रयास करें, ताकि आपके नमूने को एक छोटी पतली परत (5 मिमी से नीचे की सिफारिश की गई मोटाई) के साथ कवर किया जा सके। यदि अशुद्धियां बहुत दूर हैं, तो इस मोटाई को स्वाभाविक रूप से बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह अनुशंसा नहीं की जाती है कि आपके नमूने की मोटाई 2 सेमी से अधिक है, जब तक कि उत्पाद बस धोया नहीं जाता है।
बहुत से लोग यह सोचने की गलती करते हैं कि अधिक सिलिकॉन को जोड़ना, भले ही यह मेरे नमूने पर मोटा हो, क्या इसे अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है? यह उत्तर नकारात्मक है!
कारण यह है कि इन लोगों ने कभी नहीं सोचा था कि नीचे और ऊपर के नमूने एक ही लाइन पर नहीं चल रहे थे, इसलिए वे केवल कुछ शुद्ध लोगों को प्राप्त कर सकते थे, जिनमें से अधिकांश को पार किया गया था, अशुद्धियों का उल्लेख नहीं करने के लिए, समय और सॉल्वैंट्स बर्बाद करने के लिए!
यही कारण है कि नमूने को पतले होने की आवश्यकता है!
कॉलम का चयन करने के बाद, सिलिकॉन जोड़ना एक फीडिंग फ़नल के माध्यम से किया जा सकता है। उसी समय, एक मास्क पहनना सुनिश्चित करें और एक धूआं हुड में काम करें। इसका कारण ब्लॉगर (सिलिकोसिस) द्वारा विस्तृत नहीं किया जाएगा।
सिलिका जेल की घुसपैठ के रूप में, अनुशंसित प्रक्रिया है: सबसे पहले, सिलिका जेल के साथ सिलिका जेल के स्तंभ को लंबवत रूप से स्थापित करें, सिलिका जेल की सतह को अपने हाथ से समतल करें, सिलिका जेल स्तंभ के नीचे को एक पानी के पंप से जोड़ें, सिलिका जेल को पंप करें, और फिर ऊपर से कम से कम ध्रुवीय एलुएंट में डालें। जब एलुएंट लीक होने वाला है, तो पानी के पंप में पंप किए जाने से विलायक को रोकने के लिए शट-ऑफ वाल्व को बंद करें।
फिर, दबाव में, सिलिकॉन जेल को समान रूप से विकासशील एजेंट की सबसे छोटी मात्रा के साथ सात या आठ कॉलम वॉल्यूम को फ्लश करके भिगोया जा सकता है।
ऊपर नमूना
नमूने को गीले नमूने और सूखे नमूने में विभाजित किया गया है।
(१) गीला नमूना।
अनुशंसित विधि नमूना को चूसने के लिए एक रबर की टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग करना है, सिलिकॉन जेल के शीर्ष खंड के करीब, धीरे -धीरे और समान रूप से नमूना को तब तक टपकता है जब तक कि यह एक परत को कवर न करे, फिर नमूना को जोड़ना बंद कर दें और सिलिकॉन जेल परत में तैलीय पदार्थ को डुबोने के लिए कुछ दबाव लागू करें; ऑयली पदार्थ को सिलिकॉन परत में विसर्जित करें और इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएं जब तक कि सभी नमूनों को लोड न कर दिया जाए!
कुछ नए छात्र उत्सुक हो सकते हैं कि इस ऑपरेशन को गीली प्रक्रिया के तेल को कोटिंग के बजाय एक ही बार में पदार्थ की तरह क्यों किया जाता है?
वास्तव में, यह ऑपरेशन नमूना परत की प्रभावी ऊंचाई को कम कर सकता है। इस बिंदु पर, कॉलम क्रोमैटोग्राफी पहले ही शुरू हो चुकी है, और बाद के नमूने सॉल्वैंट्स की तरह हैं जो पिछले नमूनों को सिलिका जेल में Adsorb और Desorb में धकेलते हैं।
(२) सूखे नमूने के लिए।
जब तक पूरी तरह से आवश्यक नहीं है, यह अनुशंसित नहीं है। ठोस नमूनों को अधिक पीटा या क्रिस्टलीकृत करने की सिफारिश की जाती है। "बेईमान तरीके, एथिल एसीटेट बनाम पानी, अल्ट्रासोनिक दोलन उच्च उबलते तेल के क्रिस्टलीकरण में सहायता प्राप्त क्रिस्टलीकरण" और "एक प्रयोगशाला पुनरावर्तन विधि साझा करना" की सिफारिश की जाती है।
सूखा नमूना आम तौर पर दो समस्याएं लाता है; एक ओर, नमूना मिश्रण प्रक्रिया के दौरान, नमूना और सिलिका जेल के बीच प्रतिक्रिया की संभावना रोटरी वाष्पीकरण के लिए तापमान बढ़ाने की आवश्यकता के कारण बढ़ जाती है; दूसरी ओर, सूखी लोडिंग का मतलब है कि adsorbents को नमूना परत में पेश किया जाएगा, जिससे नमूना परत की ऊंचाई या स्तंभ के आकार में वृद्धि होगी, जिसमें अधिक समय और अधिक विलायक की आवश्यकता होती है।
यदि कोई अन्य विकल्प नहीं है, तो बस लोड करने के लिए कॉलम में धीरे -धीरे adsorbed पाउडर डालें, कुछ आवश्यकताओं के साथ गीले तरीकों के समान।
निर्जल सोडियम सल्फेट या क्वार्ट्ज रेत जोड़ें
एलुएंट के अलावा नमूना परत को प्रभावित करने से बचने के लिए, असमानता, विरूपण, और पृथक्करण दक्षता को प्रभावित करने के लिए, निर्जल सोडियम सल्फेट या क्वार्ट्ज रेत की एक परत आमतौर पर नमूना परत के शीर्ष पर रखी जाती है।
हमारे इंजीनियर व्यक्तिगत रूप से निर्जल सोडियम सल्फेट रखना पसंद करते हैं क्योंकि इसमें एक सुखाने का कार्य भी होता है और यह सॉल्वैंट्स जैसे कि डाइक्लोरोमेथेन के अनुकूल है, जो वाष्पीकरण, गर्मी अवशोषण और संक्षेपण के लिए प्रवण हैं!
ग्रेडिएंट एल्यूशन, सैंपलिंग और कलेक्शन
लोड करने के बाद, पहले एक छोटे ध्रुवीय विलायक (एक विलायक जो उत्पाद को पास करने की अनुमति नहीं देगा) के साथ कॉलम को कुल्ला करता है 2-3 कॉलम वॉल्यूम के लिए (एक कॉलम वॉल्यूम को परिभाषित किया गया है, जो मोबाइल चरण की मात्रा के रूप में और बाहर बहने वाले) के रूप में परिभाषित किया गया है, और फिर एकरूपता के लिए एक अनुपात का चयन करें।
कॉलम से गुजरने वाले एलुएंट को कैसे चुनें?
जब आपका उत्पाद TLC प्लेट पर 0 के लगभग 0 के RF मान तक पहुंचता है, तो eluent का अनुपात वह अनुपात है।
यह कॉलम वॉशिंग का अनुभव है जिसे मैंने कई पुस्तकों को पढ़ा है और साझा किया है, और वास्तविक प्रक्रिया भी बहुत समान है। व्यक्तिगत रूप से, मैं दो बार ढाल को कम करना पसंद करता हूं।
उदाहरण के लिए, यदि TLC प्लेट चढ़ाई के लिए विलायक PE/ea =2: 1: 1 है, तो ब्लॉगर को Pe/ea =4: 1 से ग्रेडिएंट एल्यूशन शुरू करने की अधिक संभावना है और 1 और PE/ea =2: 1 पर समाप्त होता है, आमतौर पर बेहतर परिणामों में परिणाम होता है।
एलुएंट को इकट्ठा करते समय तकनीकें भी हैं। आप पहले इसे प्राप्त करने के लिए एक बड़ा परीक्षण ट्यूब चुन सकते हैं, और जब टीएलसी लक्ष्य बिंदु पर पहुंच रहा है, तो एक छोटे परीक्षण ट्यूब पर स्विच करें। यह अधिक प्राप्त करने और अशुद्धियों से बचने की संभावना को कम कर सकता है।
यदि आप उन स्थितियों का सामना करते हैं जहां अशुद्धता बिंदु और उत्पाद बिंदु एक साथ करीब हैं, विशेष रूप से कमजोर प्रतिदीप्ति वाले, याद रखें कि दबाव लागू नहीं करना है। इसके बजाय, सामान्य दबाव के तहत कॉलम को पास करने के लिए चुनें, और हर बार आधे या उससे कम ट्यूब जुड़े होने पर ट्यूब को बदलें, जो शुद्धिकरण संभावना को भी बढ़ा सकता है।
याद रखें कि समय पर स्तंभ को संभालना नहीं है!
बहुत से लोगों को यह मानने की आदत है कि बाद के चरण में टीएलसी के बाद एक या दो ट्यूबों में कोई उत्पाद नहीं होने पर कॉलम को पारित और सुखाया गया है।
मुझे केवल यह महसूस हुआ कि जब मैंने इसकी गणना की, या जब मैं एक स्पेक्ट्रम बनाने गया तो उपज बहुत कम थी, मैंने पाया कि स्पेक्ट्रम गलत था और गलत बिंदु से चूक गया। मुझे इसका गहराई से पछतावा हुआ।
इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि आप वांछित बिंदु को पूरा करने के बाद कॉलम को संसाधित करने के लिए जल्दी न करें। इसके बजाय, प्रसंस्करण से पहले उपज से मेल खाने के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद करें।
यदि आप व्यस्त हैं या इसके साथ अन्य यौगिकों को शुद्ध करने की जल्दी मेंपारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी, यह एक उच्च ध्रुवीयता सौम्य मिश्रित विलायक के साथ कुल्ला करने की सिफारिश की जाती है और पहचान के परिणामों के लिए अलग से एलुएंट के इस हिस्से को छोड़ दें।
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